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热献 差示扫描量热仪解析DNA熔融的显微结构
来源:技术文章    发布时间:2020-05-29    浏览:63次
  差示扫描量热仪解析DNA熔融的显微结构
 
  1.   简介
 
  担负着遗传信息的DNA,即使是归类于小种类的大肠菌,其染色体DNA的大小也巨大到约4700kb(1kb=1000碱基对),如果就这样处理的话是很困难的,染色体DNA独立地存在于细胞质,进行自律增殖数质粒DNA小到数kb到数百kb,处理起来比较容易,所以经常被分子生物学作为研究对象或者研究手段。小型的质粒DNA,作为物理化学的研究对象也是便利的材料。
 
  DNA是由鸟尿环(G),胞嘧啶(C),腺嘌呤(A),胸腺嘧啶(T)4种碱基的共有结合而形成的2条互补链,通过GC间和AT间的氢结合以及邻接碱基对间的如垛状的弱结合力形成的2根链。因为具有这种构造的DNA在比较低的温度下解离(被称为融解或者螺旋-线圈转变等)成一条链,通过很多物理手段是可以观测的。又因为其比较简单的模型,所以将其进行理论化也相对比较容易。另外DNA的融解与细胞内复制、转写、重组等的遗传基本现象有关,所以也成为了生物学和物理学的连接桥梁。
 
  我们知道DNA的融解是在数十碱基对到数百碱基对间共同发生的。这被称为融解的显微结构,此现象到目前为止主要通过紫外吸收、电子显微镜、凝胶电泳等方法观察的。虽然通过热测定来解析显微结构的报告目前为止是没有的,这是因为热测定中使用的DNA是染色体DNA和合成核苷酸这种巨大的DNA,或者如Oligo一样是极小的DNA构成的。比如染色体DNA的场合,因为个体过于大,各个显微结构重合成一个整体,所以只能观测到一个幅宽的波峰,而合成核苷酸的场合,因为碱基排列均一而且个体小,所以其特性会扩及分子整体从而影响结果。
 
  通过不断的实验,我们发现使用被称为pJL3-TB5的5277碱基对而来的质粒DNA,初次对DNA融解的显微结构利用差示扫描量热仪(DSC)是可以测定的。而且,通过全碱基排列的理论性计算,就可以利用DSC曲线来解析碱基排列和遗传因子。
 
  这里,将阐述DSC测定Co/E1质粒得理论性解析结果。
 
  Co/E1是从6646碱基对而来,是产生抗菌性物质大肠杆菌素E1的遗传因子cea堆积的质粒。而且Co/E1可以通过添加氯霉素来增加其产量,有容易得到样品的优点。
 
  2.   方法
 
  样品:前述的Co/E1质粒用铯-溴化乙锭法,再通过2次的超远心分离精制而成。得到的质粒由于变为闭环状,所以难以产生融解不能观测显微结构。限制性内切酶EcoRI因为只识别Co/E1这个单一的位置,所以通过EcoRI切断Co/E1使其变为直链状。
 
  用上述精制的Co/E1DNA330μg溶于60μl的1×SSC缓冲液(实际上是通过超滤溶媒置换),放入70μl的密封样品容器中进行测定。升温速度0.5K/min。
 
  通过利用融解曲线和变性图进行理论计算:对于Co/E1DNA的全碱基排列6646碱基对,用AT和GC这2种进行分配参量,并分别在69.5℃和110.5℃时进行计算。
 
  3.   DSC曲线
 
  图1-(1)是用上述方法得到的Co/E1DNA的DSC曲线。83℃开始到98℃能看到DNA阶段性的融解时的11个波峰。(2)是降温过程的DSC曲线,显示了暂时从1根链中解离的DNA再度和2根链会合的过程,(3)显示的是再升温过程的DSC曲线,再会合的2根链DNA再次解离的过程。曲线(2),(3)的各波峰分离虽然没有(1)那样好,会合、再融解的反应也是阶段性进行的。曲线(4)是通过理论推断得到的融解曲线。这里纵轴表示的是各温度下螺旋线含量的温度微分。(1)和(4)的各波峰标注的号码,表示分别对应的波峰。虽然有若干的差异,但是DSC曲线和理论曲线近乎一致。这表示理论推断的可信性相当高,使得进一步的解析变得可能。
 
  4.   变性状态的理论性解析(变性图)
 
  通过观察DSC曲线上各波峰前后的DNA变性状态,可以知道分子链上哪一个领域的融解分别对应哪个波峰。因此变性图是将某个温度下各碱基对变成线圈状态(解离状态)的概率对应到各碱基对位置而制成的图表。图2显示的是图1-(4)的理论融解曲线中,各波峰的前后用a.b.….j表示的各温度的变性图计算结果。图的横轴,通过限制酵素EcoRI将切断点作为原点。涂满黑色的地方是融解的部分。DSC曲线上各波峰,是DNA分子链哪个部分的融解就很容易了解到。比如,DSC曲线的波峰1,相当于图2的变性图中a的状态变化为b的状态,是碱基位置100到400的领域的变性和5050到5200的小区域的变性叠加的结果。而且,从此图可以了解到融解是互相协同进行的。比如图的左侧的低温下融解的部分,到相当高的温度为止融解虽然不是向内部进行,但是在某一温度下会急速的在广区域中融解的现象产生。右侧部分也可以看到是同样的共同融解。这样的情况如果做成热稳定性图的话会变得更加明了。
 
  5.   变性图和遗传因子图的比较
 
  图2的上部,显示的是Co/E1的遗传因子图。和变性图比较的话在遗传因子的顶端(涂层区域和非涂层区域连接部分)很多场合溶解的方式是在变化的。也就是,表示涂层区域和非涂层区域稳定性上存在差异。与图2相邻的变形图之间取差或者制作热稳定性地图进行调查的话,这个情况更加明显。如此融解区域内存在差异,是否仅仅是反映进化过程中碱基置换或重组,还是对于遗传性机能发现有特别的意义是一个有趣的问题,现在仍然不是很清楚。
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